Fabriquer son milieu gélosé à base d’agar [Tutoriel]

La gélose, le milieu gélosé ou encore la boite de pétri est un milieu de culture essentiel et obligatoire lors des rites de passage initiatiques vers le monde de la culture fongique en laboratoire. Ce type de milieu, généralement coulé dans des boites, est utilisé pour sélectionner, cloner ou encore sauvegarder les meilleures souches de champignons. Ce milieu est solide et plat, ce qui nous permet d’observer les hyphes du mycélium se propager à sa surface et de voir facilement les problèmes éventuels de contaminants pour obtenir des souches dites pures. Normalement, assez complexe d’accès, je vous offre dans cet article la manière la plus simple que j’ai trouvé pour réaliser ces fameux milieux de culture.

Pourquoi utiliser un milieu de culture gélosé ?

Il y a plusieurs raisons qui poussent un myciculteur à utiliser une gélose :

Isoler des souches

Les fructifications ou le mycélium de champignons, qu’ils proviennent d’une récolte ou bien directement de la forêt ne sont pas souvent « pure », par nature ! Le champignon comporte assez souvent sur lui, des contaminants naturels, qui s’ils sont transférés avec lui sur des milieux comme du grain, ou encore de la paille, vont naturellement contaminé et donc concurrencé les ressources, diminuant le potentiel de votre culture de champignons. Le milieu gélosé permet de vérifier si les cultures sont contaminées et par la suite de les purifier sur une autre gélose.

Conservation à moyen terme

Si vous souhaitez conserver au frigo une souche de champignon, c’est idéal, car si vous l’utiliser un autre support comme le grain ou la culture liquide, quelque mois après la mise en culture, il vous aura difficile d’observer une éventuelle contamination latente ces milieux. Sur une gélose, la lecture est plus claire.

Cloner des souches

Si vous avez des souches existence sur mycélium sur grain, sur culture liquide ou sur d’autres géloses, vous pouvez vous en servir pour les répliquer sur une gélose et en conserver une nouvelle copie. Cette nouvelle gélose ensemencée peut avoir pour fonction de vérifier la pureté des souches comme nous l’avons dit, mais également de servir de base biologique pour ensemencer de nouvelles cultures liquides ou substrats de grain durant une nouvelle saison de myciculture, tous en conservant une base saine de la souche.

Le matériel nécessaire pour fabriquer votre gélose

  • Des coupes en plastique : ce sont les conteneurs dans lesquels nous allons mettre notre milieu gélosé, en soit une boite de pétri faite maison. Alors personnellement, j’ai choisi de petites coupelles en plastique qui sont autoclavables. Elles résistent à une stérilisation de 20min à 120°C. Ils existent d’autres modèles. Si vous souhaitez en acheter d’autres modèles que les miennes, je vous conseille de regarder pour un plastique en polypropylène (noté PP, sur les coupelles, voir généralement PP5, donc du polypropylène de qualité alimentaire.
    => Lien pour des coupelles en plastiques PP5
  • Un stérilisateur ou une cocotte minute avec une grille de fond : l’appareil nous permettra de faire monter en température votre mélange et la grille du fond permettra un support pour poser nos boites de pétri maison.
  • Une fiole : elle nous servira à faire le mélange d’ingrédients pour la gélose. Vous pouvez utiliser n’importe quel récipient tant qu’il vous permet de mesurer un volume et que vous pouvez verser facilement le liquide qu’il contiendra.
  • Les ingrédients de la gélose : Vous avez plusieurs recettes pour réaliser vos boites de pétri gélosé. Vous allons réaliser le milieu le plus classique et simple à faire, le milieu MEA.
  • Une source biologique de champignon : On s’en servira à la fin du tutoriel pour ensemencer notre milieu gélosé. Vous pouvez utiliser des cultures liquides, du mycélium sur grain, des fruits de champignons, ou encore une autre gélose.
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Les ingrédients pour le milieu gélosé

Le milieu MEA que nous allons réaliser convient à de très nombreuses espèces de champignons comestibles et médicinaux :

Le milieu MEA ne contient donc que 3 ingrédients :

  • De l’extrait de malt (ME = Malt Extract) : C’est la source de nutriment de votre gélose. Le malt contient principalement du maltose, mais également d’autres types de sucre, ce qui permet à de nombreux champignons de métaboliser facilement cette nourriture.
    => Lien pour de l’extrait de malt
  • De l’agar en poudre ( A = Agar) : C’est un agent gélifiant issu des algues qui précipite dans l’eau pour former de la gélatine lorsqu’il est chauffé. Il nous permettra d’obtenir un milieu solide.
    => Lien pour de l’agar en poudre.
  • De l’eau : c’est le solvant de notre formule nutritive. L’eau du robinet convient très bien.

Préparation de la gélose

Pour préparer le milieu nutritif, je vais commencer par mettre un fond d’eau tiède dans ma fiole de 250 ml. Elle me permettra de dissoudre plus facilement les éléments en poudre.

Le milieu MEA est un milieu nutritif simple à préparer
Préparation du milieu gélosé

Ensuite, je rajoute :

  • 5g d’agar en poudre.
  • 5g d’extrait de malt.

Je referme et je remue pour homogénéiser. Il est très important que les éléments soient bien répartis.

Une fois que c’est fait, je peux disposer mes petites coupelles et couler ma gélose à l’intérieur. 0,5 à 1 cm d’épaisseur pour la gélose est largement suffisant. Le mycélium ne se propage pas en profondeur dans les milieux gélosés. Pour un premier essaie, je vous conseille de simplement tapisser le fond de votre stérilisateur pour déterminer le nombre de boites. Si cela fonctionne, vous pourrez essayer de stériliser davantage de boites de pétri fabrication maison.

Dans ce processus, les géloses sont coulés avant la stérilisation
Coulage des géloses

Je ferme les couvercles des boites au fur et à mesure. Il peut arriver que quelques boites s’ouvrent avec la pression, vous pouvez alors placer les géloses dans une feuille d’aluminium si besoin.

Dans mon stérilisateur, je place un fond d’eau, la grille en métal, et je place un torchon propre, bien à plat, sur le dessus pour éviter de marquer mes géloses avec la forme de la grille durant le processus. Enfin, je place soigneusement mes milieux gélosés. Et c’est parti pour 20min de stérilisation à 15psi. Si vous avez une cocotte minute classique, vous pouvez compter 30min environ.

L'agar de la gélose à besoin de chauffer pour solidifier
Préparation à la stérilisation du milieu gélosé

Laisser ensuite refroidir le stérilisateur durant 3 à 4h. La température doit redescendre suffisamment pour que les milieux se solidifient. Une fois refroidit, préparer un coin propre pour sortir vos géloses. Je conseille au minimum un bec Bunsen, car ce type de milieu nutritif est très sensible à la contamination.

Sortez les géloses une par une dans la zone de travail. Si vous allez utiliser de l’aluminium, enlevez-le dans la zone de stérilité. Vous pouvez ensuite mettre les géloses dans un sac zip pour les conserver de manière encore plus hermétiques.

Les milieux nutritifs peuvent être conservés au frigo pour la suite.
Les milieux gélosés sont placés dans des sacs zips pour la conservation.

Vos géloses sont prêtes à être utilisées ou bien stockées au frigo ! Vous pouvez les conserver aussi longtemps qu’elles ne sont pas contaminées.

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Ensemencement du milieu gélosé

Le milieu gélosé peut être ensemencé par de nombreuses sources biologiques, en fonction de vos besoins. Je vais prendre pour exemple la création d’une sous-culture. Je vais utiliser une boite de pétri pour ensemencer une autre boite de pétrie vierge.

La manipulation doit être réalisée dans un endroit propre donc comme tous à l’heure, minimum le bec Bunsen, idéalement la hotte à flux laminaire. Pour ma part, je vous montrerai la manipulation au bec Bunsen.

Commencez par bien nettoyer votre surface de travail et installer tout ce dont vous avez besoin pour la suite. C’est-à-dire :

  • Une boite de pétri vierge
  • Une boite de pétri ensemencée
  • Le bec Bunsen
  • Un scalpel.

Avant d’allumer la flamme du bec, passer à l’alcool vos mains et les boites de pétri. Allumez seulement ensuite le bec. Vous pouvez également utiliser une solution de javel à 10 %. Poursuivez en passant à la flamme votre scalpel jusqu’à ce qu’il rougisse, pour bien le stériliser. Patientez quelques secondes pour qu’il refroidisse.

Vérifier au préalable les géloses d’ensemencement. Si elles ne sont pas contaminées, vous deviez apercevoir seulement du mycélium blanc se diffusant de manière radiale, il est possible que de l’eau soit présente sur le mycélium est le rende légèrement plus sombre par endroit.

Les milieux gélosés sont très sensibles à la contamination
Un milieu gélosé ensemencé et contaminé.

Si les boites que vous avez arborent une autre couleur que du blanc, il est très probable que celle-ci soit contaminée. Vous pouvez fermer et jeter ces boites, ou bien tenter de récupérer un morceau de mycélium sain pour le cloner sur une autre boite.

Ouvrez donc votre boite de pétri qui contient votre souche de champignons et découper proprement un petit carré ou triangle de mycélium. Piquez-le au bout du scalpel. Ensuite, fermer la boite de prélèvement. Ouvrez la boite de pétri vierge, et déposez le morceau de gélose en son centre. Refermez la boite.

L'ensemencement des milieux nutritifs doit se faire en condition de propreté.
Ensemencement d’un milieu gélosé

Incubation et vérification de la gélose.

À présent, il est tant d’incuber la gélose. Cela permettra au mycélium de se développer. 24°C sans lumière dans votre incubateur. Au bout de 2 à 3 jours, le mycélium aura commencé à se propager sur la gélose.

Vous observerez vite s’il y a des contaminations ou pas sur votre gélose, comme expliquer plus haut. Si c’est le cas, vous ne pourrez pas stocker sans risque votre souche de champignon, il faudra de nouveau l’isoler sur une nouvelle gélose.

La sous culture consiste à cloner une gélose sur une autre gélose
Sous-culture sur milieu gélosé réussie

Si vous n’avez pas de contamination, et bien bravo. Vous pouvez stocker au frigo durant au moins 6 mois, votre souche de champignons, et vous en servir pour fabriquer des cultures liquides ou du mycélium sur grain par la suite.

Merci d’avoir lu cet article sur le milieu gélosé en culture de champignon ! Si vous avez des questions ou des remarques, n’hésitez pas à nous laisser un commentaire 🙂

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