La culture mycologique stérile est retrouvée à plusieurs étapes de la culture des champignons. Plusieurs outils et techniques sont utilisés pour garder des cultures ou des milieux mycologiques stériles tout au long des différents processus de culture. Nous allons passer en revue tous ces aspects dans ce guide complet.
Pourquoi la Stérilité est-elle Essentielle pour la Culture Mycologique?
La stérilité est essentielle en culture mycologique pour éviter la contamination par des organismes indésirables, comme des bactéries ou d’autres moisissures, qui se développent souvent plus vite que le mycélium.
Sans conditions stériles, ces contaminants peuvent rapidement envahir le substrat et empêcher la croissance du champignon cultivé. Elle garantit aussi la pureté des souches et la réussite des étapes sensibles comme l’inoculation. En somme, la stérilité conditionne la qualité et la rentabilité de la culture.
Qu’est-ce qu’une culture mycologique stérile?
Une culture mycologique stérile est une méthode de culture de champignons réalisée dans des conditions exemptes de tout micro-organisme contaminant (bactéries, moisissures, etc.).
Elle permet de travailler uniquement avec le mycélium souhaité, en le cultivant sur des milieux nutritifs comme l’agar, culture liquide ou le grain. Pour garantir la stérilité, on utilise des outils désinfectés et un environnement contrôlé (hotte à flux laminaire ou boîte à gants). Cette approche est essentielle pour produire un mycélium sain et vigoureux.
Les risques de contamination lors de la culture de champignons
Les risques de contamination lors de la culture de champignons sont élevés, surtout aux étapes stériles comme l’inoculation ou la préparation des substrats. Des moisissures, bactéries ou levures indésirables peuvent s’installer et concurrencer le mycélium, le ralentir ou le détruire.
Ces contaminations peuvent provenir du cultivateur, de l’air, du substrat, des outils, de l’inoculum ou encore d’unités mobiles de contamination. Elles entraînent des pertes de temps, de matériaux et de récoltes.
Pour en savoir plus sur les risques de contamination, je vous invite à lire l’article sur les 6 sources de contaminations.
Comment la stérilité affecte-t-elle la croissance des champignons?
La stérilité permet au mycélium de se développer sans concurrence, en lui offrant un environnement sûr et contrôlé. En absence de contaminants, les nutriments du substrat sont entièrement disponibles pour le champignon, ce qui favorise une croissance rapide et saine.
À l’inverse, un manque de stérilité peut ralentir, affaiblir voire bloquer totalement le développement du mycélium. De plus les nutriments sont consommés par les autres micro-organismes concurrents. Elle est donc cruciale pour optimiser le rendement final et la qualité de la culture.
Équipement Nécessaire pour Créer un Environnement Stérile
Quel équipement est essentiel pour la culture mycologique?
Pour une culture mycologique réussie, certains équipements sont essentiels pour garantir la stérilité et la précision des manipulations.
- Hotte à flux laminaire ou boîte à gants : elles créent un environnement stérile pour les opérations sensibles comme l’inoculation.
- Autoclave ou cocotte-minute : utilisés pour stériliser substrats, outils et milieux de culture.
- Bocaux ou sacs filtrants : contiennent le substrat ou les grains colonisés par le mycélium.
- Milieux nutritifs (comme l’agar-agar) : pour les cultures sur boîte de Petri.
- Boîtes de Petri : pour isoler, observer et tester les souches.
- Scalpel ou bistouri : pour effectuer les transferts de mycélium.
- Briquet ou bec Bunsen : pour stériliser les outils en cours de manipulation.
- Thermomètre et hygromètre : pour contrôler les conditions de culture.
- Gants, masque, désinfectant : pour limiter les contaminations humaines.
- Incubateur (facultatif) : pour maintenir une température stable durant la colonisation.
Pour en savoir plus sur le matériel, je vous conseille de lire l’article suivant : Le matériel indispensable pour son laboratoire à champignons, à la maison.
Comment utiliser une hotte à flux laminaire?
Une hotte à flux laminaire est un équipement qui filtre l’air à travers un filtre HEPA pour créer un espace de travail stérile, protégé des contaminants. Pour l’utiliser, il faut l’allumer 15 à 30 minutes avant toute manipulation afin de purifier l’air.
Ensuite, on désinfecte soigneusement la surface de travail avec de l’alcool isopropylique. On travaille au centre du flux d’air, en gardant les objets stériles du côté du filtre. Il est important de limiter les mouvements brusques et de désinfecter régulièrement les mains et les outils.
Pour comprendre le fonction en profondeur et construire vous-même une hotte à flux laminaire, je vous suggère de regarder cet article : Hotte à Flux Laminaire DIY.
Le rôle des boîtes de pétri dans la culture de champignons
Les boîtes de Pétri jouent un rôle fondamental dans la culture de champignons, en particulier lors des étapes de laboratoire. Elles sont utilisées pour cultiver le mycélium sur un milieu nutritif, généralement à base d’agar, ce qui permet d’observer sa croissance de manière contrôlée.
Elles servent à isoler des souches, vérifier leur pureté et sélectionner les plus vigoureuses. Grâce à elles, on peut repérer rapidement les contaminations et les éliminer avant qu’elles ne se propagent. Les boîtes de Pétri permettent aussi de réaliser des transferts de mycélium vers d’autres milieux ou substrats. Leur format transparent facilite l’observation sans ouverture, ce qui limite les risques de contamination.
Elles sont indispensables pour conserver des souches dans une mycothèque (une bibliothèque de souche à champignons), notamment lorsqu’on utilise l’agar sous forme de tubes penchés. On les utilise également pour expérimenter différentes conditions de croissance.
Pour réaliser vous-même simplement vos premières boîtes de pétri, vous pouvez lire l’article suivant : Fabriquer son milieu gélosé à base d’agar [Tutoriel].
Techniques de Stérilisation pour Éviter la Contamination
Quelles méthodes de stérilisation peuvent être utilisées?
Plusieurs méthodes de stérilisation sont utilisées en culture mycologique pour éliminer les micro-organismes indésirables.
- Stérilisation à la vapeur sous pression : réalisée avec un autoclave ou une cocotte-minute, elle est indispensable pour stériliser les substrats nutritifs, comme les grains, utilisés pour l’inoculation.
- Stérilisation à la vapeur sans pression : utilisée pour les substrats de fructification (paille, copeaux, sciure), généralement via une pasteurisation prolongée entre 85 °C et 95 °C pendant plusieurs heures. J’ai également réalisé un article sur le sujet : Pasteurisation vapeur DIY
- Stérilisation à la chaleur sèche : adaptée aux outils de laboratoire comme les scalpels, qui sont insérés dans un tube chauffant en céramique (type mini four chauffant) pour les rendre stériles rapidement avant manipulation.
- Stérilisation chimique : consiste à désinfecter les surfaces, gants et matériels avec de l’alcool isopropylique à 70 %, ou parfois avec une solution diluée d’eau de Javel selon les cas.
- Rayons UV : utilisés au-dessus de la hotte à flux laminaire ou dans les humidificateurs pour limiter la charge microbienne, mais ils ne stérilisent qu’en surface et ne remplacent pas une vraie stérilisation.
Chaque méthode est choisie en fonction du type de support, de l’étape de culture concernée et du niveau de stérilité requis.
Comment stériliser le substrat pour la culture fongique?
Voici les étapes de stérilisation en cocotte-minute pour un milieu générique (que ce soit de l’agar, une culture liquide ou un substrat de grain) :
- Préparation du milieu :
- Pour agar : mélange eau, agar-agar, et nutriments (ex. : malt ou PDA).
- Pour culture liquide : mélange eau et sucre (ex. : miel, sirop de maïs).
- Pour grain : fais tremper, égoutte et remplis les bocaux sans trop tasser.
- Conditionnement :
- Verse le milieu dans des bocaux ou flacons adaptés (ajoute du film aluminium pour éviter l’eau de condensation lors de la stérilisation).
- Ajoute des couvercles avec trous filtrés (polyfill, Tyvek ou micropore) pour permettre les échanges gazeux sans contamination.
- Chargement dans la cocotte-minute :
- Mets 2–3 cm d’eau au fond avec une grille ou torchon.
- Place les bocaux droits, sans qu’ils se touchent de trop.
- Stérilisation :
- Chauffe à feu fort jusqu’à mise en pression (15 psi / 1 bar), puis maintiens :
- 20–30 min pour agar ou culture liquide
- 90–120 min pour les grains
- Chauffe à feu fort jusqu’à mise en pression (15 psi / 1 bar), puis maintiens :
- Refroidissement :
- Laisse refroidir naturellement, sans ouvrir la cocotte avant dépressurisation complète.
- Sors les bocaux dans un environnement stérile ( devant une hotte à flux laminaire par exemple) et laisse-les reposer à température ambiante avant toute manipulation.
Ces étapes assurent la destruction des spores, bactéries et moisissures, quelle que soit la nature du milieu.
Importance de la désinfection des outils et de l’équipement
La désinfection des outils et de l’équipement est cruciale pour éviter l’introduction de contaminants lors des manipulations mycologiques. Un simple scalpel ou couvercle mal désinfecté peut suffire à ruiner une culture entière.
Cette désinfection est particulièrement recommandée pour des outils pour les scalpels, les ciseaux ou les boucles d’ensemencements que l’on utilise en environnement stérile.
Utiliser de l’alcool isopropylique à 70 % ou une flamme permet de neutraliser les micro-organismes présents en surface. Cela garantit un environnement propre pour le mycélium. Une rigueur constante dans la désinfection augmente fortement les chances de réussite des cultures. Plus on est parano de la contamination en myciculture, plus on a de chance de réussir.
Création et Gestion d’un Environnement Stérile
Comment créer un environnement stérile pour la culture mycologique?
Plusieurs solutions existent pour créer un environnement stérile, de la plus simple à la plus avancée:
- Le four domestique peut faire office de mini-station stérile tant qu’il reste chaud.
- Le bec Bunsen crée un flux d’air chaud ascendant qui repousse les contaminants.
- La glove box, boîte hermétique désinfectée, est une solution DIY efficace.
- La Shmuvbox, gonflée avec de l’air filtré HEPA, offre une alternative mobile.
- La hotte à flux laminaire, très utilisée par les professionnels et les amateurs enjoués, génère un flux d’air purifié constant grâce à un filtre HEPA.
- Enfin, la salle blanche, bien que coûteuse, est idéale pour les gros volumes avec contrôle total des flux d’air. Chaque méthode présente des avantages selon le budget, le volume de culture et le niveau de propreté nécessaire.
Vous pouvez lire en détail le fonctionnement de ces outils dans cet article : L’environnement stérile pour la culture des champignons : 6 méthodes.
La meilleure pratique pour assurer la stérilité de l’air
Pour assurer la stérilité de l’air, l’utilisation d’une hotte à flux laminaire équipée d’un filtre HEPA H14 est l’une des meilleures solutions : elle retient 99,995 % des particules >0,3 μm. Ce filtre crée un flux d’air purifié unidirectionnel qui chasse les contaminants de la zone de travail. Il est essentiel de travailler dans un environnement propre, en limitant les mouvements perturbateurs.
En salle blanche, une pression positive permet de repousser l’air extérieur contaminé vers l’extérieur. Ces pratiques réduisent fortement les risques de contamination lors des manipulations.
Pour fabriquer votre propre hotte à flux laminaire vous pouvez lire cet article.
Comment la circulation d’air influence-t-elle la contamination?
La circulation d’air influence fortement la contamination en myciculture : un air en mouvement désordonné peut transporter et déposer des spores ou bactéries sur les supports stériles. Les turbulences créées par des gestes brusques, des ventilateurs ou une mauvaise ventilation favorisent la dispersion des contaminants.
À l’inverse, un flux d’air laminaire (par exemple celui d’une hotte) dirigé et filtré repousse les particules loin de la zone de travail. Travailler dans un espace calme, sans courants d’air parasites, est essentiel. Une bonne maîtrise de la circulation d’air limite les risques lors des transferts.
Même si vous ne travaillez pas avec une hotte à flux laminaire, il est conseillé de manipuler dans un environnement fermé, sans courant d’air.
Choix et Préparation du Milieu de Culture
Quels sont les différents milieux stériles de culture pour les champignons?
Il existe plusieurs types de milieux de culture adaptés aux différentes étapes de la culture mycologique.
- Les géloses (agar-agar) sont des milieux solides, généralement enrichis en sucres (PDA, MEA, etc.), utilisés pour isoler, purifier et observer la croissance du mycélium en boîte de Petri.
- Les cultures liquides, à base d’eau et de sucres (comme le miel ou le sirop de maïs), servent à développer rapidement du mycélium en suspension, facile à injecter dans des substrats.
- Le mycélium sur grain (seigle, blé, maïs, riz…) est la forme la plus courante d’inoculum : les grains stérilisés sont colonisés par le mycélium, puis utilisés pour ensemencer des substrats de fructification.
- Les tubes penchés, remplis de gélose solidifiée en biais, sont utilisés pour conserver des souches sur le long terme dans un petit volume, souvent à température fraîche.
Chaque milieu a son rôle dans la chaîne de culture, du clonage à l’inoculation à grande échelle.
Comment préparer un milieu de culture stérile?
Voici comment préparer un milieu de culture stérile pour chacun des 4 types utilisés en myciculture :
- Géloses (agar-agar)
- Mélange 20 g d’agar-agar, 20 g de sucre (glucose, malt, ou extrait de levure), et 1 L d’eau.
- Verse dans un bocal ou une bouteille résistante à la chaleur.
- Stérilise en cocotte-minute pendant 30 minutes à 15 psi.
- Une fois tiède (50–55 °C), verse dans des boîtes de Petri stériles devant une hotte ou dans une glove box.
- Culture liquide (LC)
- Mélange 40 g de sucre (miel, sirop de maïs, dextrose…) pour 1 L d’eau.
- Verse dans des flacons avec bouchon percé et filtre respirant.
- Stérilise à la cocotte-minute 20–30 minutes.
- Laisse refroidir complètement avant d’inoculer avec du mycélium.
- Mycélium sur grain
- Fais tremper les grains (seigle, blé, maïs…) 12–24 h, puis cuis-les 10–15 min pour les hydrater.
- Égoutte bien pour éviter l’excès d’eau, puis remplis les bocaux ou sacs à moitié.
- Ajoute un couvercle avec filtre (polyfill, micropore, Tyvek).
- Stérilise 90 à 120 minutes à 15 psi, puis laisse refroidir 12–24 h avant inoculation.
- Tubes penchés (slants)
- Prépare une gélose classique (voir agar ci-dessus), verse-la chaude dans des tubes à essai.
- Ferme avec un bouchon respirant (ouate, aluminium…) et stérilise 30 minutes.
- Incline les tubes pendant le refroidissement pour créer une surface en pente, dans un environnement stérile.
- Ces tubes servent à stocker les souches au réfrigérateur pendant plusieurs années.
La stérilité est cruciale à chaque étape : travaille toujours dans un environnement désinfecté et évite toute exposition prolongée à l’air libre.
Les substrats les plus utilisés dans la culture mycologique stérile
En culture mycologique stérile, les substrats les plus utilisés sont les grains céréaliers (seigle, blé, millet, riz), très nutritifs et idéaux pour le développement du mycélium. C’est également un très bon milieu pour débuter en mycologie stérile.
La sciure de bois (souvent de feuillus) est couramment utilisée pour les espèces lignicoles comme les reishi ou shiitake. On utilise aussi des mélanges avec du son de blé, du plâtre, ou du calcaire pour enrichir les substrats.
Pour les cultures sur agar, le milieu nutritif gélosé à base de malt ou pomme de terre est standard. Ces substrats sont toujours stérilisés avant inoculation pour éviter les contaminations.
Merci d’avoir lu cet article sur les cultures mycologiques stériles. Si vous avez des remarques ou des questions, n’héistez pas à nous laisser un commentaire :).